阿基米德粒子檢測系統 Archimedes Particle Metrology System
-------------以不可思議的精度重新定義粒子/細胞質(zhì)量和分析
美***麻省理工學(xué)院(MIT)的世界頂***傳感器大師Scott Manalis教授開(kāi)創(chuàng )性的微通道諧振器微機電系統（MEMS），***次實(shí)現精確測量fg(10-15 g)***粒子的質(zhì)量，其驚人的測量底限比目前***好的石英微天平方法高出***百萬(wàn)倍。MEMS技術(shù)成為粒子分析的***新黃金標準。
詳細說(shuō)明
阿基米德為粒子分析設定了***個(gè)全新標準，它采用共振質(zhì)量檢測原理準確定量粒子質(zhì)量、尺寸、體積、密度和濃度等，其極高的分辨率遠超過(guò)了現有的粒子分析方法如動(dòng)態(tài)光散射、激光衍射和布朗運動(dòng)跟蹤，并***次實(shí)現了fg***納米粒子的質(zhì)量檢測。阿基米德對每個(gè)粒子單獨檢測，無(wú)需光學(xué)部件，檢測樣品與測量信息直接關(guān)聯(lián)，測量結果更為真實(shí)可靠。阿基米德不僅可以用于顆粒的重量和大小，未來(lái)該系統還可與HPLC連接作為密度檢測器，可以目前檢測器所不能檢測到的化合物。
阿基米德質(zhì)量測量底限示意圖:
儀器特點(diǎn)
* 自動(dòng)檢測粒子大小質(zhì)量、尺寸、體積、密度及濃度
* 粒子檢測范圍<50 nm-5 μm
* 檢測快速，NIST標定校準
* ***小樣品消耗，低至100 μl
* 極高的分辨率，***性和重現性
原理：共振質(zhì)量測量
阿基米德對單個(gè)粒子及活細胞的質(zhì)量進(jìn)行檢測，分辨率低于1飛克 (10-15 g)，遠超過(guò)其它流體質(zhì)量測量方法，核心在于共振微流控通道和共振質(zhì)量測量，它采用機械共振結構，當粒子或細胞***個(gè)個(gè)依次通過(guò)共振器時(shí)，共振頻率因粒子重量而下降。通過(guò)檢測共振頻率的改變，***測量每個(gè)粒子的質(zhì)量及大小。
* 共振器采用微電子機械系統制備方法，傳感器僅100 μm大小，總質(zhì)量?jì)H數ng，如此小巧輕薄的傳感器對即使很小的加載重量也非常靈敏。
* 微通道傳感器被置于真空環(huán)境中，傳感器的振動(dòng)不會(huì )消散不必要的能量，從而達到極高的品質(zhì)因子Q，通常> 10,000，因此共振頻率檢測可達極高的準確度。
* 傳感器中嵌入***個(gè)微流通道，全新的應用流體設計可將樣品自動(dòng)送入傳感器，并精確控制流速，結合極高的Q值，使傳感器更換十分迅速，實(shí)現快速測量且結果準確。***些生物樣本如活細胞甚至可以在生理條件下測量。
* 共振頻率測量十分快速且分辨率高，1 kHz 頻寬時(shí)可達到十億分之***水平。
阿基米德功能
***、粒子質(zhì)量和大小檢測
阿基米德檢測單個(gè)粒子及活細胞的重量，其核心在于微通道共振器頻率偏移與粒子物理特性間的關(guān)系，即物體的浮力重量等同于它排出液體的重量。因此粒子浮力質(zhì)量可定義為它所替代液體的質(zhì)量，浮力質(zhì)量與粒子干重相關(guān)，它隨著(zhù)粒子與流體的密度偏離而增加。當粒子通過(guò)微通道時(shí)，浮力質(zhì)量導致共振頻率偏移，當粒子到達共振器頂部時(shí)共振偏移達到***大，且與粒子浮重成比例。
阿基米德微通道傳感器靈敏度常數s將共振頻率偏移與粒子浮力質(zhì)量關(guān)聯(lián)，對于每個(gè)傳感器s數值固定，反映了所測粒子范圍的簡(jiǎn)單線(xiàn)性關(guān)系。動(dòng)態(tài)光散射只能檢測成千上萬(wàn)粒子的平均數值，而阿基米德可實(shí)現單個(gè)粒子測量，大量粒子的共振頻率偏移依次檢測，從而得到單個(gè)粒子重量、體積、等效球體直徑等，由此建立準確的粒子群體質(zhì)量和大小分布。
二、粒子密度檢測
浮力質(zhì)量導致共振頻率偏移。假如粒子密度比流體密度大，粒子經(jīng)過(guò)傳感器時(shí)其總體質(zhì)量增加，共振頻率下移；假如流體密度比粒子密度大，傳感器整體質(zhì)量減小，共振頻率上移。***終如果粒子密度與流體密度等同，傳感器質(zhì)量不變，即浮力重量為零，則不會(huì )發(fā)生共振偏移。因此，可以應用調節流體密度直到共振頻率偏移消失的方法測量粒子密度。
但上述描述顯然很繁瑣。阿基米德開(kāi)辟了***個(gè)新的更為簡(jiǎn)便的方法，只需將樣品分別置于二種不同密度的流體中各檢測***次，得到每個(gè)樣品的浮力質(zhì)量均值。如下圖，多孔硅粒子分別在0.786 g/cc異丙醇和1.106g/cc氘化水中檢測。結果顯示，粒子平均浮力重量在異丙醇中比氘化水大，分別為1.67pg、1.10pg。得到浮力重量數據，阿基米德通過(guò)簡(jiǎn)單的線(xiàn)性外推法就能自動(dòng)計算出粒子平均密度。
三、粒子濃度及內含物檢測
阿基米德以***真實(shí)的計數方法對每個(gè)粒子單獨檢測，通過(guò)流控技術(shù)精確監控整個(gè)測量過(guò)程中樣品流速，可提供信息包括粒子濃度 [#/ml]、樣品消耗 [μl]、固形物含量 [parts per billion]。這些信息可廣泛應用于
* 監測蛋白制劑中聚集物含量
* 監測細菌生長(cháng)及抗生素易感性
* 檢測藻類(lèi)及其它生物燃料中的生物量
* 評估油墨中阻塞打印頭的附聚物
四、極微小差異粒子區分
阿基米德可以極好的區分不同粒子質(zhì)量或大小的極微小差異，下左圖顯示二種粒子大小僅差40nm，阿基米德對粒子群體也能準確區分，且標準方差不到標準參數的***半，標準誤差達到單個(gè)?水平。右圖顯示三種形態(tài)分布的黃金粒子，標定為 57 nm、79 nm、100 nm，阿基米德檢測結果為57 nm、81 nm、99 nm。DLS方法檢測卻無(wú)法分辨此三種粒子，所測粒子大小也明顯有誤。
五、混合粒子分析
阿基米德***性可達NIST 1%水平。以下四種不同標定的標準品混合物，阿基米德可單獨分析每個(gè)亞群，得出粒子平均大小與標準參數相差僅0.1%-0.5%。此外在不同批次的傳感器和儀器之間也能體現極好的重現性。
阿基米德應用
***、蛋白制劑檢測
蛋白療法可以緩解多種人類(lèi)疾病，也可以替代非內源產(chǎn)生的關(guān)鍵蛋白，蛋白制劑在蛋白治療中起著(zhù)關(guān)鍵的運輸作用，但是蛋白聚集會(huì )降低其療效，因此十分有必要監測它在研發(fā)、生產(chǎn)、存儲及運輸治療蛋白或其它生物藥劑過(guò)程中的聚集情況。
粒子聚集
阿基米德可以準確測量粒子聚集，大小低至100nm。它不再受光學(xué)或形狀變化及阻礙光學(xué)方法的乳白光的影響。其柔和的流體控制不會(huì )擾亂微弱聚集，且可適應粘度達50cP而無(wú)需稀釋。阿基米德傳感器非常小，皮升***體積，僅需樣本100 μl，可承受聚集濃度達5x108/ml，對于高濃度制劑無(wú)需稀釋。聚集測量通過(guò)單個(gè)粒子的檢測直接測得濃度。下圖顯示4 μl 原始樣品中亞微米IgG蛋白聚集物的大小分布，所測濃度 >300 nm粒子聚集物是 4x106/ml（左圖）?；跈z測數目龐大，其分布可以計算為組成每個(gè)聚集物的基礎蛋白數量。
外源物區分
阿基米德也能將外源物質(zhì)從蛋白聚集物中區分。如下圖，向下的峰由聚集引起，其密度高于懸液密度。另外可見(jiàn)***些向上的峰，由硅油滴引起，密度小于懸液，它們的存在減小了傳感器的總質(zhì)量，使共振頻率增加?；谶@些顯著(zhù)差異阿基米德可以準確區分聚集物與油滴，并可作出每個(gè)群體粒子大小分布。
總而言之，阿基米德可以定量分析蛋白制劑中顯微可見(jiàn)物甚至亞微米物質(zhì)，它為早期聚集過(guò)程中制劑質(zhì)量和外源物含量提供了很有價(jià)值的反饋信息，且相對光學(xué)方法能提供更多的信息。
二、微生物/細胞檢測
阿基米德柔和的樣品流動(dòng),確?？梢栽谏頎顟B(tài)下,提供前所未有的活細胞檢測,檢測結果要遠遠超越庫爾特技術(shù)和流式細胞技術(shù),獲得***精確的細胞質(zhì)量分布,監測細菌生長(cháng),以及在***寬廣的動(dòng)力學(xué)范圍內進(jìn)行全血檢測.
整個(gè)細菌高分辨率的體外檢測在微生物學(xué)應用方面有重要意義，包括研究細菌生命周期以及對環(huán)境的反應，細菌作為模式生物探討分子進(jìn)程和信號通路，傳染病中抗體發(fā)現和抵抗力研究。目前常規光密度法能檢測整個(gè)培養體系濃度，但無(wú)法測量單個(gè)細菌及其物理性能，庫爾特計數器的體積限度無(wú)法滿(mǎn)足個(gè)體小的細菌檢測。
阿基米德是***個(gè)可用于單個(gè)細菌物理性能測量的儀器，且分辨率極高，同時(shí)也能定量評估整個(gè)培養系統。阿基米德亞飛克***的質(zhì)量分辨率比普通細菌質(zhì)量的1%還小，它能實(shí)時(shí)跟蹤細菌生長(cháng)變化過(guò)程，監測其生長(cháng)速率、質(zhì)量和大小分布，不同階段的過(guò)渡如指數增長(cháng)和平穩期，對環(huán)境因素如溫度、營(yíng)養、抗菌劑的反應。此外，阿基米德還能結合高放大率視頻直接觀(guān)察細菌形態(tài)和集體行為。它可廣泛應用于分子通路模型研究、抗菌藥物研發(fā)、藥敏測試等。
細菌質(zhì)量檢測
下圖顯示了大腸桿菌ATCC 25922檢測結果。每個(gè)向下峰即代表單個(gè)細菌通過(guò)微通道傳感器，并引發(fā)共振頻率降低。直方圖顯示浮力質(zhì)量和大小的分布，均值分別近250fg和1.8μm。除質(zhì)量檢測外，阿基米德還整合了高放大率的視頻來(lái)揭示單個(gè)細菌進(jìn)入傳感器入口時(shí)的情形。
細菌生長(cháng)檢測
阿基米德可實(shí)時(shí)監測微生物群生長(cháng)變化，包括質(zhì)量增長(cháng)和聚集運動(dòng)等。下圖顯示E. coli 25922從穩定期至生長(cháng)期的監測。紅點(diǎn)表示每個(gè)細菌的浮力重量和相應的檢測時(shí)間。直方圖顯示培養液細菌質(zhì)量分布及培養成熟度，初始培養45min后，細菌質(zhì)量分布寬泛，顯示凝集跡象，這很可能源于curli菌毛的生成和蛋白附屬物介導的細菌的粘附。凝集歷經(jīng)65min后轉變成生長(cháng)階段，此時(shí) E. coli 大多鞭毛驅動(dòng)運動(dòng)進(jìn)行有絲分裂約20min，質(zhì)量分布變窄，集中在230fg。
M. Godin等應用阿基米德原理，在***個(gè)比細胞自身生長(cháng)周期更短的時(shí)間內捕獲細胞，分別檢測4種不同的細胞系瞬間生長(cháng)速率，對于每個(gè)捕獲事件，其生長(cháng)速率取決于捕獲開(kāi)始時(shí)的細胞浮力質(zhì)量。結果表明，越重的細胞相對質(zhì)量輕的生長(cháng)越快。
Using Buoyant Mass to Measure the Growth of Single Cells,M. Godin etc., NATURE METHODS, (2010)
細菌對環(huán)境的反應
營(yíng)養成分影響
已處于生長(cháng)階段的少量E. Coli 加入新鮮Luria培養基。E. Coli 快速經(jīng)歷細胞周期，三小時(shí)內其平均濃度顯著(zhù)增加，呈指數增長(cháng)。細菌內部參數表現穩定，包括平均體積、密度和細胞分子組成等。
A.K. Bryan等研究了酵母細胞在不同試劑處理后各生長(cháng)周期不同階段細胞密度、體積和質(zhì)量的變化。數據分析表明細胞密度和生長(cháng)速率是與其生長(cháng)周期協(xié)調***致的。
Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast, A.K. Bryan etc., PNAS, 2010
抗體影響
初始培養約2.75小時(shí)后，加入100 μg/ml氨芐青霉素，約為達到抑制生長(cháng)***小量的10倍。4min重取樣間隔時(shí)間內，細菌數量停止增長(cháng)，抗生素效應在極短時(shí)間內得以評估。此外，細菌總數開(kāi)始下降，40min后群體完全消失。由于氨芐青霉素干擾細胞壁生長(cháng)有殺菌性，細菌很快破碎。這在上面直方圖中有體現，可以看到大量低質(zhì)量碎片。共振質(zhì)量測量也曾用于檢測抗生素抗性，基于它們對滲透休克的反應。
溫度影響
E. coliK12分別生長(cháng)于20℃與36℃，虛線(xiàn)代表不同溫度下細菌生長(cháng)狀況。
三、顏料和墨水檢測
顏料的理化性質(zhì)對于其在終產(chǎn)品中的性能尤為關(guān)鍵，如油漆、化妝品、噴墨油墨。目前
激光衍射廣泛用于評估顏料特性。但是顏料對應波長(cháng)不同的吸光值以及形狀和大小的影響，使其折射率很難精確定量，因此光散射結果存在不確定性。此外需要將初始顏料粒子從可形成不穩定分散液的聚集物中區分開(kāi)來(lái)，***般儀器很難做到，且基于光學(xué)的儀器都無(wú)法檢測不透明產(chǎn)物狀態(tài)的顏料，如油漆和油墨。
阿基米德則擅長(cháng)測量顏料，它不受任何光學(xué)特性變化的影響，對每個(gè)顏料粒子直接檢測，包括質(zhì)量或者等效球體的直徑，并能輕易區分原始顏料和聚集物，同樣也能評估顏料在油墨、油漆或化妝品中分散的穩定性。
顏料粒子檢測
如下圖，分析了軍用***別的顏料和添加劑，包括樣品群體的質(zhì)量、等效球體直徑、標準差及其它統計數據，結果突出顯示了平均直徑與D10/D90。
顏料懸液檢測
阿基米德浮力質(zhì)量也能用于檢測顏料或添加劑懸液。下圖顯示了相同的LaMnO4樣品分散于異丙醇的頻移時(shí)間圖，它記錄了因LaMnO4粒子比溶液密度大(5.5 vs 0.8 g/cc)而產(chǎn)生的向下峰以及液滴輕于異丙醇而產(chǎn)生的向上峰，其中12%為正浮力液滴，它可能源于表面活性物質(zhì)或者陷于顏料混合物中的空氣在液滴懸浮時(shí)的釋放。群體監測結果顯示它在約1小時(shí)內分散并消失。相比之下，氧化鋯和氧化鎳樣品則不含如此多低密度的氣泡或液滴。
墨水檢測
同***類(lèi)型墨水分別準備4份，乙酸乙酯1000：1稀釋?zhuān)瑱z測表明粒子大小***致約130nm。對未稀釋的原樣進(jìn)行檢測，由于濃度太高 (> 1011/ml) 導致無(wú)法進(jìn)行單個(gè)粒子檢測，因此設定檢測>1 μm粒子，觀(guān)察由懸液中不穩定聚集及引發(fā)的結絮。結果顯示更大量聚集樣品中粒子濃度數量有顯著(zhù)差異。更大聚集量樣品濃度與更長(cháng)的保質(zhì)期相關(guān)，也與樣品造成噴墨噴嘴堵塞問(wèn)題相關(guān)。
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