大小鼠50%縮足閾值攻略——疼痛量化的精準評估
嚙齒動(dòng)物的臨床前模型對于探索病理生理機制以及尋找新型鎮痛藥物而言，具有不可估量的價(jià)值。然而嚙齒動(dòng)物的疼痛評估往往充滿(mǎn)挑戰，它們對機械或熱刺激的反應變化，被用作衡量疼痛敏感性的行為指標。由于動(dòng)物無(wú)法用語(yǔ)言表達自己是否感到疼痛，所以可以用縮足反應來(lái)代替對感覺(jué)的語(yǔ)言報告，當實(shí)驗動(dòng)物感受到疼痛時(shí)，爪子會(huì )立即收縮。
十九世紀九十年代，生理學(xué)***Maximilian von Frey提出疼痛是***種獨立的觸覺(jué)特性，與觸摸、熱和冷并列，且與高閾值自由神經(jīng)末梢的刺激有關(guān)，來(lái)測量機械性疼痛（針刺痛覺(jué)），是目前評估實(shí)驗鼠機械性疼痛的常用方法。 1983年Dixon使用Von Frey纖維絲提出了up–down method，1994年Chaplan SR等為了檢測嚙齒動(dòng)物50%縮足閾值將此方法做了進(jìn)***步的修改，up–down method是在目標力水平的5%標準差范圍內單獨校準，非常準確。目前引用up–down method文獻已達上萬(wàn)篇，是機械痛閾測量的金標準。且在測量縮足閾值的出版文獻中，大約60%使用了up–down method或其修正版本。 在實(shí)驗開(kāi)始之前可以先用Von Frey纖維絲對實(shí)驗動(dòng)物進(jìn)行預實(shí)驗，測量實(shí)驗動(dòng)物縮足閾值的大致范圍，以完成實(shí)驗動(dòng)物和纖維絲的篩選。盡可能選擇縮足閾值相近的實(shí)驗動(dòng)物和連續編號的纖維絲以保證實(shí)驗數據的精確性。 取***系列North Coast Von Frey纖維絲（如 0.4、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0g，共9根），我們取中位數 4.0g 開(kāi)始對動(dòng)物腳掌中部皮膚進(jìn)行刺激，纖維絲彎曲至“C”或“S”型并維持6-8s，觀(guān)察動(dòng)物是否縮足并記錄；每根纖維絲測試5次，每次間隔15s，五次有三次縮足即可認為有反應 。注意區別由于身體活動(dòng)引起的縮足反應； 動(dòng)物無(wú)反應記為“O”，有反應（縮足或舔足）記為“X”。無(wú)反應時(shí)，給予大******力度的纖維絲刺激（即4.0g的纖維絲刺激動(dòng)物腳底沒(méi)有反應時(shí)，下***步選擇6.0g的纖維絲繼續刺激），有反應時(shí)則改用小******的纖維絲刺激（即4.0g的纖維絲刺激動(dòng)物腳底動(dòng)物出現縮足反應，下***步選擇2.0g的纖維絲繼續刺激），反復類(lèi)推； 當動(dòng)物出現“OX”（第***次沒(méi)縮足反應，第二次有縮足反應）或“XO”（第***次有縮足反應，第二次沒(méi)有縮足反應） 的騎跨時(shí)，重復之前的操作步驟，再連續往后測量四次，得到***串以“O”或“X”組合的序列①，將該序列與***后***根測試絲的編號輸入動(dòng)物50%縮足閾值公式，計算出動(dòng)物的50%縮足閾值； 動(dòng)物50%縮足閾值（g）=（10^[Xf+kδ]）/10000，其中 Xf ②為***后***根測試絲編號，如下圖所示8.0g的north coast纖維絲編號為4.93。δ為所取各根纖維絲克數取對數后的均差，這個(gè)數值和north coast纖維絲編號很相近，為了方便計算，因此δ可以近似認為是所選纖維絲編號的均差即δ＝（***大纖維絲編號-***小纖維絲編號）/（n-1），n為所選纖維絲的數量。k為根據測量獲得的“X”、“O”序列查表后獲得的系數值。 這里所說(shuō)的“O”或“X”組合的序列是指從***開(kāi)始測試進(jìn)行記錄，出現騎跨值往后再記錄四次，即***少六位，***高九位的***個(gè)序列，低于六位的序列不予考慮。如動(dòng)物在***開(kāi)始就在 4.0 和 6.0 之間出現騎跨，而后幾次測試依舊反復，則其序列 為“OXOXOX”；若動(dòng)物開(kāi)始沒(méi)出現騎跨，而后在 8.0 和 10.0 之間出現騎跨并反復，則其序列為“OOOXOXOX”； Xf 在這里直接使用測試絲編號，但亦有文獻使用***后***根絲目標力度值（以 mg 為單位）10 倍的對數值作為 Xf 代入公式 計算，即 Xf=lg（10000f），其中 f 為纖維絲目標力度（g）。我們以此法換算出的 Xf 值與纖維絲本身編號數值很相近，因此可直接使用纖維絲編號作為 Xf 代入計算。 在0.4、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0g，共9根纖維絲，我們選擇中間的 4.0g 力度開(kāi)始測試 第***輪： 選擇4.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發(fā)生3次及以上的縮足反應(O) 選擇6.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發(fā)生3次及以上的縮足反應(O) 選擇8.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中發(fā)生3次及以上的縮足反應(X) 此時(shí)發(fā)生了第***次騎跨，重復之前的測試繼續往后測四輪 第二輪： 選擇6.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發(fā)生3次及以上的縮足反應(O) 第三輪： 選擇8.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中發(fā)生3次及以上的縮足反應(X) 第四輪： 選擇6.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發(fā)生3次及以上的縮足反應(O)第五輪：選擇8.0g纖維絲刺激五次，每次間隔15s，五次中未發(fā)生3次及以上的縮足反應(O) 第***步 根據序列確定k值： 此序列為OOXOXOO 根據k值表可知k＝0.039 ； 第二步 根據編號算均差： 將這9根纖維絲對應的編號（3.61、4.08、4.17、4.31、4.56、4.74、4.93、5.07、5.18）取均差δ＝（5.18-3.61）/（9-1）＝0.19625； 第三步 確定Xf： ***后***根纖維絲為8.0g，可在north coast纖維絲上查看到對應的編號為4.93； 第四步 代入公式計算： 代入公式計算可以得出g＝10[4.93+0.039*0.19625]/10000＝10 0.93765 ，根據科學(xué)計算器可以得出動(dòng)物50%縮足閾值（g）＝8.66g，即為動(dòng)物50%縮足閾值。 若從4.0g開(kāi)始，動(dòng)物連續四次出現反應（即到0.4g動(dòng)物仍出現縮足或舔足反應）或連續四次未出現反應（即到 15.0g 動(dòng)物仍不出現縮足或舔足反應），即可直接使用 0.4g或15.0g作為動(dòng)物50%縮足反應閾值； 若***開(kāi)始已出現騎跨反應，但測試到***小或***大纖維絲時(shí)不足 4 次（如 XXXOXX），則繼續使用***小或***大纖維絲按照Up–Down method測量記錄，以排除假陽(yáng)性或假陰性可能。 North Coast Von Frey纖維絲痛閾測試包，是用于評估皮膚觸覺(jué)靈敏度的經(jīng)典工具。由20根不同規格的Von Frey纖維絲組成，單只可分為纖維絲頭、保護套和手柄三部分。測量絲的力度為0.008克-300克。Von Frey纖維絲觸覺(jué)測試不僅可應用于大、小鼠的足底，在臨床上也廣泛使用，可用于觸覺(jué)測試及高知覺(jué)和低知覺(jué)診斷。 研究機械感受受體編碼機制: 通過(guò)測定不同纖維直徑對應的感受閾值,可推斷不同種類(lèi)感受受體的特性 ； 評估神經(jīng)損傷后重建: 觀(guān)察纖維絲刺激感受閾值的恢復,可監測神經(jīng)再生和功能修復過(guò)程 ； 研究疼痛調控機制: 使用動(dòng)物模型,研究藥物或干預措施對機械性疼痛閾值的影響,有助于認識疼痛調控通路。 評估周?chē)窠?jīng)損傷程度: 通過(guò)測定患者對纖維絲刺激的感知閾值,可判斷感覺(jué)神經(jīng)功能的損害程度。這有助于診斷和監測周?chē)窠?jīng)病變 ； 診斷糖尿病神經(jīng)病變: 糖尿病患者常出現機械性感覺(jué)異常,使用纖維絲可客觀(guān)評估感覺(jué)神經(jīng)功能,有助于診斷糖尿病周?chē)窠?jīng)病變 ； 評估中樞性疼痛: 中樞性疼痛如脊髓損傷后疼痛,可使用纖維絲評估機械性感覺(jué)閾值的變化, 幫助診斷。 部分用戶(hù)名單
| 上海交通大學(xué)醫學(xué)院附屬新華醫院 | 大連醫科大學(xué) | 中南大學(xué)湘雅醫院 |
| 中山大學(xué)附屬腫瘤醫院 | 中山大學(xué) | 復旦大學(xué)附屬華山醫院 |
| 四川大學(xué)華西醫院 | 第四軍醫大學(xué) | 上海市第六人民醫院 |
| 中***人民解放軍總醫院 | 浙江大學(xué) | 武漢大學(xué)人民醫院 |
| 西京醫院 | 吉林大學(xué) | 中日友好醫院 |
| 北京大學(xué)口腔醫院 | 中***科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 | 天津醫科大學(xué)總醫院 |
參考文獻 1. H wang, Sung-Min et al. “Specific transcription factors Ascl1 and Lhx6 attenuate diabetic neuropathic pain by modulating spinal neuroinflammation and microglial activation in mice.” Biomedicine & pharmacotherapy =Biomedecine & pharmacotherapie vol. 173 (2024): 116392. doi:10.1016/j.biopha.2024.116392 2. Chen, Szu-Han et al. “Ultrahigh frequency transcutaneous electrical nerve stimulation for neuropathic pain alleviation and neuromodulation.”Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, vol. 21,3 e00336. 16 Feb. 2024, doi:10.1016/j.neurot.2024.e00336 3. Rein, Ben et al. “MDMA enhances empathy-like behaviors in mice via 5-HT release in the nucleus accumbens.” Science advances vol. 10,17 (2024): eadl6554. doi:10.1126/sciadv.adl6554 4. Messina, Diego N et al.“Complex alterations in inflammatory pain and analgesic sensitivity in young and ageing female rats: involvement of ASIC3 and Nav1.8 in primary sensory neurons.” Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society ... [et al.] vol. 73,4 (2024): 669-691. doi:10.1007/s00011-024-01862-z 5. Wang, Siyuan et al. “HK2 in microglia and macrophages c
