實(shí)驗干貨 | 從分子克隆到細胞轉染全解析
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從分子克隆到細胞轉染全解析
通過(guò)表達或者敲低來(lái)研究基因對功能的影響是細胞生物學(xué)中常用的手段，熒光蛋白的發(fā)現也為研究追蹤細胞動(dòng)態(tài)和變化提供了有效的工具。因此將某個(gè)基因引入細胞系，或者細胞系中敲除/敲低某個(gè)基因不可避免地需要經(jīng)過(guò)轉染這個(gè)過(guò)程。功能完整的質(zhì)粒需要從分子克隆開(kāi)始小心的設計，避免造成功能元件的缺失或者artifacts。本文從分子克隆開(kāi)始講述如何構建***個(gè)在哺乳動(dòng)物細胞中正常表達的質(zhì)粒，以及如何將該質(zhì)粒遞送（轉染）到細胞系中。 分子克隆 分子克隆的目的是把自己想要表達的基因安裝在表達載體上，這樣表達載體轉染進(jìn)細胞后可以啟動(dòng)目的基因的表達。因此，表達載體或質(zhì)粒，需要包含必須的幾個(gè)原件來(lái)啟動(dòng)目的基因的表達，同時(shí)方便細胞轉染后的篩選。 質(zhì)粒的基本組成部分
完整的質(zhì)粒通常包括：?jiǎn)?dòng)子（promoter, 用以啟動(dòng)目的基因的表達），目的基因(GOI)，終止子（terminator or polyA, 用以終止基因的表達），復制起始位點(diǎn)（ori, 用來(lái)質(zhì)粒的擴增，真核表達載體有的含有兩個(gè)復制起始位點(diǎn)包含質(zhì)粒在大腸桿菌中擴增的ori和f1 ori），抗性基因（用來(lái)在大腸桿菌和細胞中篩選陽(yáng)性克?。?。有的真核細胞表達載體還含有其他原件，用來(lái)增強基因表達過(guò)程中的穩定性（如AAV載體中的WPRE），方便病毒包裝（AAV和lenti載體中的兩端重復序列），控制多個(gè)基因表達（IRES和P2A元件等）。有的還會(huì )同時(shí)表達熒光蛋白方便后期細胞的篩選。經(jīng)典的質(zhì)粒圖譜如下（由SnapGene生成）：
分子克隆 分子克隆類(lèi)似于打補丁，把其他地方得到的目的基因通過(guò)PCR或者酶切的方式得到，并粘貼到***個(gè)需要的表達載體上。因此整個(gè)過(guò)程設計PCR，酶切，片段回收，連接轉化，測序，質(zhì)粒擴增和抽提。簡(jiǎn)短的示意圖以Takara的In Fusion為例： 1 PCR PCR的目的是為了得到可以用來(lái)連接的目的基因，通過(guò)兩端引物的擴增得到自己想要的目的序列，在這個(gè)過(guò)程中可以通過(guò)引物的設計添加或者刪除酶切位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)等。需要注意的是，如今市面上多種多樣的高保真酶可以確保堿基突變的概率很低，甚至可以用這些高保真酶擴增長(cháng)片段，高GC，多序列重復的載體序列。 2 酶切 得到的PCR產(chǎn)物需要插入到自己的表達載體上，通常質(zhì)粒為超螺旋閉環(huán)狀，因此需要合適的限制性?xún)惹忻盖虚_(kāi)對應位點(diǎn)，以方便目的基因的插入。切開(kāi)的質(zhì)粒通常需要回收骨架部分，舍棄掉原來(lái)位置上的基因。建議使用NEB***的限制性?xún)惹忻?，沒(méi)有星號活性，Buffer基本通用，可以靈活的調節和控制酶切反應及時(shí)間。對于沒(méi)有想要的酶切位點(diǎn)的載體，可以利用步驟1中的PCR方式獲取。 3 片段回收 為了獲得高純度，去除反應液中的離子，通常需要DNA瓊脂糖凝膠電泳來(lái)回收酶切或PCR得到的目的基因和載體（膠回收）。通常***后的洗脫用去離子水或者雙蒸水，以方便下***步的使用。 4 連接轉化 常用的分子克隆手段有很多，如普通的酶切連接（依賴(lài)T4 DNA 連接酶），In Fusion (依賴(lài)于外切酶)，GoldenGate (依賴(lài)TypeIIS型限制性?xún)惹忻竸?chuàng )造的獨特切口），Gibson組裝（外切酶，聚合酶，連接酶同時(shí)作用），CPEC（高保真DNA聚合酶）等。連接轉化后的產(chǎn)物通常轉化到感受態(tài)細胞中，以獲得單克隆。 5 測序 重組得到的單克隆菌落有的時(shí)候會(huì )有錯配或者突變，堿基的缺失等，因此需要挑選單克隆菌落測序。通常測序前會(huì )通過(guò)菌落PCR和酶切驗證，但是如前所說(shuō)，現在的DNA高保真聚合酶大大減少了突變的發(fā)生，而目前的連接方法組裝正確率都很高，因此為節約時(shí)間，我選擇平板隨機挑選兩個(gè)菌落送測。 6 質(zhì)粒擴增和抽提 測序成功的質(zhì)?？梢灾匦罗D化感受態(tài)，挑取單克隆培養后選擇小提/中提/大提質(zhì)粒。值得注意的是，用于轉染的質(zhì)粒***好使用去內毒素質(zhì)粒提取盒。
轉染 轉染前的準備
轉染之前需要準備細胞，***般細胞復蘇后傳1-2代觀(guān)察形態(tài)和狀態(tài)，如果條件嚴格的話(huà)還需要檢查是否有支原體污染或者黑膠蟲(chóng)等。細胞狀態(tài)良好的，形態(tài)完整活力較好的，匯合度達到80-90%后可以接種細胞。接種細胞前需要計數，有條件的推薦RWD***的細胞計數儀。以293T為例***個(gè)示意的形態(tài)圖(匯合度>90%)和細胞狀態(tài)如下：
▲ 10倍鏡下?tīng)顟B(tài)
轉染 經(jīng)典的轉染方式包括磷酸鈣，脂質(zhì)體（以Thermo的lipo2000/3000為代表），PEI （25, 0000 or 40, 000），慢病毒侵染等，每周轉染方式大同小異，具體原理就不******贅述。以下以經(jīng)濟實(shí)用的PEI轉染為例： 1 準備試劑 無(wú)血清培養基(DMEM or opti-MEM), PEI (1mg/mL)，待轉染的DNA質(zhì)粒。 2 準備DNA-PEI復合物 以24孔板為例，500ng的DNA稀釋到50ul的無(wú)血清培養基中，然后按1：3（1μL PEI）的比例加入PEI （需要自己調試PEI的比例1：1-1：5，和細胞類(lèi)型和不停品牌的PEI質(zhì)量都有***定關(guān)系），混勻后靜止15min，***次性將復合物滴入到待轉染的孔。 3 （可選） 6-8小時(shí)后去除培養基，更換為新鮮的完全培養基（DMEM+10% FBS）。 4 24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀(guān)察轉染結果
通常轉染效率很高，大于90%：
▲ 瑞沃德細胞計數儀，5倍鏡下?tīng)顟B(tài)
總結 現在的分子克隆和細胞轉染的教程很多，而且很多商***的產(chǎn)品都會(huì )有詳細的介紹，從原理到具體操作。本人推薦常用到的幾個(gè)網(wǎng)站和學(xué)習資源，如SnapGene，Addgene, Takara官網(wǎng)，Thermo和NEB，FuGENE, ATCC。他們基本上是分子和細胞領(lǐng)域的權威和產(chǎn)品創(chuàng )新者，很多***內的產(chǎn)品都是在此基礎上做出來(lái)的平替。這些網(wǎng)站無(wú)論是在宣傳還是產(chǎn)品介紹上都給出了很權威且詳細的介紹。
(文章來(lái)源于儀器網(wǎng))
