徠卡175周年：入射光熒光顯微鏡的里程碑
自上世紀中葉以來(lái)，熒光顯微鏡發(fā)展成為***種生物科學(xué)工具，對我們了解生命產(chǎn)生了***大的影響。在熒光分子的幫助下觀(guān)察細胞和蛋白質(zhì)是當今幾乎所有生命科學(xué)學(xué)科的標準方法。這種廣泛的應用可以追溯到***些研究人員的技術(shù)工作，他們希望改進(jìn)和簡(jiǎn)化熒光顯微鏡下的勞動(dòng)。荷蘭醫生約翰-塞巴斯蒂安-普洛姆（Johann Sebastiaan Ploem）就是其中的***位參與者。
約翰-塞巴斯蒂安-普洛姆（Johann Sebastiaan Ploem）于 1927 年出生在蘇門(mén)答臘島的澤蘭托（Sawahlunto），是***名荷蘭煤礦工程師的兒子。幼年時(shí)，他隨父母回到荷蘭，并在那里將繪畫(huà)作為自己的愛(ài)好之***。高中畢業(yè)后，他發(fā)現了另***個(gè)令人著(zhù)迷的色彩領(lǐng)域，我們稍后會(huì )了解到。Ploem 決定學(xué)習醫學(xué)，并在烏得勒支、哈佛和阿姆斯特丹接受教育。隨后，他開(kāi)始了學(xué)術(shù)生涯，曾在邁阿密大學(xué)和阿姆斯特丹大學(xué)工作，后晉升為荷蘭萊頓大學(xué)醫學(xué)系教授。
在研究活動(dòng)中，他發(fā)現熒光顯微鏡是***種強大的工具。20 世紀 60 年代，***種特殊的標本照明方式開(kāi)始流行，事實(shí)上，早在 1925 年，對絲蟲(chóng)自發(fā)熒光事件感興趣的 Policard 和 Paillot 就已經(jīng)知道并描述了這種照明方式（Policard 和 Paillot，1925 年）。***些研究人員重新啟動(dòng)了這兩位法***科學(xué)***的項目，將熒光照明和樣品檢測放在顯微鏡的同***側。這種利用入射光的原理被稱(chēng)為 "Epi-Illumination"，與透射顯微鏡形成鮮明對比。在熒光顯微鏡中使用這種技術(shù)的***大好處是可以避免檢測光源發(fā)出的發(fā)射光（圖 1）。另***個(gè)優(yōu)點(diǎn)是機械性更強：在透射照明中，聚光器和物鏡有兩個(gè)獨立的光軸，必須仔細對準。而在外延照明中，物鏡既是聚光器，又是集光物鏡。這樣就可以避免對準問(wèn)題。
圖 1：外延照明在熒光顯微鏡中的優(yōu)勢：在透射照明的情況下（左圖），光源和圖像檢測位于物鏡的兩側。在這種設置下，***個(gè)明顯的限制就是無(wú)法檢測到激發(fā)光（淺藍色）。相比之下，Epi-Illumination（右圖）使用物鏡進(jìn)行照明和圖像檢測。對于熒光顯微鏡來(lái)說(shuō)，這意味著(zhù)用戶(hù)不會(huì )受到激發(fā)光的照射。
早在幾年前，前蘇聯(lián)的兩位研究人員就為熒光外延照明顯微鏡提供了非常重要的投入。Brumberg 和 Krylova 開(kāi)發(fā)了***種所謂的二向色分光器，用于入射光的紫外激發(fā)（Brumberg 和 Krylova，1952 年）。
二向色材料能夠讓特定波長(cháng)范圍的光通過(guò)，而其他波長(cháng)的光則被反射（圖 2）。
這***原理對于熒光外延照明是不可或缺的，因為激發(fā)光必須以某種方式融合到顯微鏡的光路中（圖 3）。更確切地說(shuō)，二向色分光鏡無(wú)法穿透光源發(fā)出的所需激發(fā)光的波長(cháng)，只能將激發(fā)光反射到樣品上。樣品發(fā)出的熒光反過(guò)來(lái)又可以通過(guò)二向色分光器到達檢測端。
圖 2：透射圖說(shuō)明了二向色分光鏡的功能。波長(cháng)較短的光（藍色箭頭）會(huì )被反射，而波長(cháng)較長(cháng)的光（紅色箭頭）則可以通過(guò)濾光器。
圖 3：熒光外延照明需要***個(gè)二向色鏡（灰色），它能夠將激發(fā)光（藍色）反射到試樣上，并將發(fā)射光（綠色）傳遞到檢測端。激發(fā)光的波長(cháng)可通過(guò)相應的濾光片（橙色）進(jìn)行預選。朝向檢測側的濾光片（紫色）只允許熒光團的波長(cháng)通過(guò)，并排除激發(fā)光的殘余雜散光。
遺憾的是，由于鐵幕之間缺乏信息交流，Ploem 并不知道俄羅斯的發(fā)展情況。盡管如此，他還是自己開(kāi)始使用二向色分光鏡。針對 Ploem 的特殊情況，他與***的特種玻璃生產(chǎn)商肖特公司（美因茨）共同開(kāi)發(fā)了***種可反射藍光和綠光的分光鏡（Ploem，1965 年）。之后，他用 Leitz 公司提供的中性分光鏡改裝了***臺 "Opak" 外延照明器，通過(guò)引入***個(gè)帶有四個(gè)不同二向色分光鏡的滑塊，他可以在紫外線(xiàn)、紫光、藍光和綠光之間非?？焖?、方便地改變激發(fā)光的波長(cháng)（Ploem，1967 年）（圖 4）。
圖 4：熒光多波長(cháng)外延照明器，帶有四個(gè)安裝在滑塊中的二向色分光鏡，用于紫外、紫光、藍光和綠光的入射照明。由阿姆斯特丹大學(xué)制造（Ploem，1965 年）。
開(kāi)發(fā)二向色分光鏡以產(chǎn)生不同波長(cháng)的激發(fā)光具有重要的優(yōu)勢。當時(shí)，紫外光譜（約 100 nm - 380 nm）的激發(fā)光非常普遍，但卻有***個(gè)惱人的副作用：自發(fā)熒光。很多組織物質(zhì)都會(huì )被紫外線(xiàn)激發(fā)，從而產(chǎn)生微弱的背景光（圖 5）。通過(guò)將二向色鏡的反射波長(cháng)調整到綠色或藍色范圍，Ploem 能夠達到當時(shí)非常常用的兩種熒光染料 FITC（494 納米）和 TRITC（541 納米）的激發(fā)***大值，而不會(huì )產(chǎn)生自發(fā)熒光。FITC（異硫氰酸熒光素）和 TRITC（四甲基羅丹明-5（和 6）-異硫氰酸酯）可與抗體耦合，目前仍用于免疫熒光顯微鏡。通過(guò)在較小范圍內達到其激發(fā)***大值，組織標本的對比度得到了顯著(zhù)增強（圖 5）。使用 Ploem 的二向色分光器產(chǎn)生的激發(fā)光束能有效地與 FITC 的激發(fā)***大值相匹配，即使是發(fā)射光譜很差的光源也能使用。
圖 5：左圖：用寬波段紫外激發(fā)光照射標記有免疫標記（FITC）的組織細胞。注意帶有藍色自發(fā)熒光的組織結構。右圖 使用窄波段藍光（490 納米）外延照明，對相同的組織和相同的 FITC 標記進(jìn)行免疫染色。注意圖像對比度的增加（Ploem，1967 年）。
有鑒于此，現在可以利用外延照明的優(yōu)勢，使用普通的高壓汞弧光燈提供藍光和綠光的窄帶激發(fā)。這***改進(jìn)滿(mǎn)足了生命科學(xué)和醫學(xué)領(lǐng)域對熒光顯微鏡的需求。
根據 Ploem 的發(fā)明，Leitz 設計出了***種新型多波長(cháng)熒光外延照明器，它帶有四個(gè)旋轉式二向色分光鏡，可在紫外、紫光、藍光和綠光范圍內激發(fā)標本，這就是 Leitz PLOEMOPAK。
萊茨員工卡夫（W. Kraft）取得了更大的成就，他將二向色分光器與適當的激發(fā)和發(fā)射濾光器組合在***個(gè)工件上，即所謂的濾光器立方體或濾光器塊（卡夫，1969 年和卡夫，1972 年）（圖 6）。他的研究成果是設計出了***種外延照明器，該照明器帶有多組四個(gè)這樣的濾光器立方體，如今幾乎所有的多波長(cháng)熒光顯微鏡都是以這些濾光器立方體為基礎的。
圖 6：左：1970 年左右，Leitz 員工 W. Kraft 將激發(fā)濾光片（橙色）、二色分光鏡（灰色）和發(fā)射濾光片（紫色）集成在***個(gè)工件上 - 濾光片立方體。中間：濾光器立方體的工程圖。右圖 在現代顯微鏡中，熒光濾光片立方體可以很方便地點(diǎn)入和點(diǎn)出。研究人員甚至可以根據自己的需要，用不同的濾光片和二向色分光器改裝***個(gè)立方體。
總 結
有了 Ploem 及其同代人和后繼者建立起來(lái)的技術(shù)基礎，我們***就可以通過(guò)將適當的濾光器立方體放入外延照明器（圖 7），觀(guān)察到無(wú)數不同的熒光團。研究人員甚至可以根據自己的需要定制激發(fā)和發(fā)射參數。
由于現代研究顯微鏡的自動(dòng)化，在實(shí)驗過(guò)程中切換濾光器立方體只需點(diǎn)擊***下按鈕?？茖W(xué)***們可以在***瞬間切換不同的熒光團，從而觀(guān)察到即使是活體標本也被熒光標記為不同的熒光團。
圖 7：熒光顯微鏡的演變。左圖：透射光熒光顯微鏡的基本問(wèn)題是檢測激發(fā)光。中圖 這就是人們利用外延照明并將光源移到顯微鏡檢測側的原因。這種方法需要二向色分光鏡。右圖 將激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片和二向色分光器放在***個(gè)區塊中，可以快速切換不同的區塊，專(zhuān)用于某些熒光團。
(文章來(lái)源于儀器網(wǎng))
