精確分析生物樣本中的小分子代謝物——IC-MS在代謝組學(xué)中的應用
高分辨質(zhì)譜（HRMS）技術(shù)結合生物信息學(xué)和統計分析是當前表征生物樣本中小分子代謝物的主要手段之***。然而，由于生物體內代謝物的結構復雜、多樣，實(shí)現生物樣本中小分子代謝物的全覆蓋鑒定和準確定量分析仍然是本領(lǐng)域的主要挑戰。其中，大極性、離子代謝物的檢測尤其受到關(guān)注。離子色譜主要使用離子交換的分離原理，和常規液相色譜主要基于疏水吸附的反相分離原理形成互補，可以很好分離常規液相色譜難以分離的強極性可電離代謝物。即使是基于親水相互作用的HILIC色譜可以分離強極性代謝物，但也難以分離強電離代謝物。離子型物質(zhì)分離，必須使用離子型物質(zhì)做為流動(dòng)相，但離子型物質(zhì)本身與質(zhì)譜的***佳檢測環(huán)境并不兼容。因此，我們需要安裝膜抑制器作為***個(gè)持續工作的脫鹽裝置，通過(guò)膜轉移的原理去除對位離子，使酸堿變成純水，從而實(shí)現與質(zhì)譜兼容。
圖1 不同極性化合物需要不同的色譜分離系統進(jìn)行分析 （點(diǎn)擊查看大圖）
分離度 核苷酸、糖類(lèi)等在代謝通路中存在多個(gè)同分異構體，這些同分異構體在細胞代謝中承擔著(zhù)不同且重要的功能。因此，我們不僅需要檢出相關(guān)化合物，更需要將這些同分異構體代謝物進(jìn)行有效色譜分離。圖2展示了IC與HILIC分析21種極性代謝物對照品的分離效果。大部分化合物在HILIC色譜柱上出峰情況良好，然而，對于磷酸糖類(lèi)以及順式、反式丁烯二酸等同分異構體代謝物來(lái)說(shuō)，HILIC的分離效果明顯差于IC。在細胞樣本的測試中，不同色譜條件下對m/z 259.0224進(jìn)行提取離子流（圖3）。IC色譜條件下檢測到了11個(gè)色譜峰，檢出數量和強度顯著(zhù)高于其他色譜條件。根據精確質(zhì)荷比信息，推測該系列化合物的元素組成為C6H13O9P，在代謝物數據庫中檢索，有至少33個(gè)代謝物符合該元素組成，其中包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖等多種重要的磷酸單糖。 圖2 21種代謝物對照品使用IC和HILIC進(jìn)行分離的峰形比較（點(diǎn)擊查看大圖） 圖 3 細胞樣本中磷酸單糖化合物在不同色譜條件下的色譜分離比較（點(diǎn)擊查看大圖） 向下滑動(dòng)查看所有內容
靈敏度 在濃度為60 ppb（0.2-0.7 μmol/L）的情況下，使用IC-MS分析極性代謝物對照品。（圖2）這些代謝物的信噪比（S/N）約為1000，相當于柱上量0.5-2.5 pmol。其中***半的代謝物可在非常低的濃度下（60 ppt，相當于柱上樣量3.4 fmol以下）被檢測到，信噪比在3到20之間。***低檢測限（LODs）的濃度范圍為0.04-0.5 nmol/L（見(jiàn)表1），展示了超高靈敏度。 表1 21種代謝物在cap IC-Orbitrap平臺的***低檢測限（LODs） （點(diǎn)擊查看大圖）
重現性 在連續6天的日間穩定性考察中，每天平行測試6針對照品混標（600 ppb），所有化合物的保留時(shí)間和響應強度RSD均小于8%，完全適應代謝組學(xué)分析要求。（圖4）在實(shí)際細胞樣本測試中，6種細胞中的11種磷酸單糖以及穩定同位素內標馬尿酸-d5的色譜保留時(shí)間和響應強度同樣表現出良好的重現性（n=3）。 圖4 日間重現性考察（n=6） （點(diǎn)擊查看大圖） 圖5 不同細胞樣本中11種磷酸單糖的離子流圖 （點(diǎn)擊查看大圖） 向下滑動(dòng)查看所有內容
代謝通路覆蓋度 采用IC-MS的方法進(jìn)行細胞代謝組學(xué)分析，幾乎完整地覆蓋了糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要代謝物。（圖6）通過(guò)相關(guān)測試結果，可以幫助我們有效觀(guān)察細胞能量代謝、代謝穩態(tài)的變化。 圖6 糖酵解、TCA代謝途徑及細胞樣本中相關(guān)代謝物含量測試結果（點(diǎn)擊查看大圖） 向下滑動(dòng)查看所有內容
小結 離子抑制技術(shù)的發(fā)展，特別是連續電解離子抑制技術(shù)，使得離子交換色譜與高分辨質(zhì)譜的結合成為可能，這種組合帶來(lái)了新的分析機會(huì )。IC-MS平臺技術(shù)的商業(yè)化推廣使得越來(lái)越多的實(shí)驗室探索了IC-MS的新應用領(lǐng)域，并揭示了超出傳統應用領(lǐng)域的成功案例。例如，除了對無(wú)機離子的分析外，有機和生物極性和離子分析物已經(jīng)成功地在廣泛的環(huán)境和生物樣品類(lèi)型中進(jìn)行了有針對性的分析和表征。使用離子抑制的IC-MS分析具有產(chǎn)生洗脫劑和極性選擇性的組合特性，減少了有效基質(zhì)復雜性，降低了質(zhì)譜檢測中可能導致分析干擾的基質(zhì)效應和色譜擁擠。分析物通常已經(jīng)處于離子形式；因此，通過(guò)質(zhì)譜檢測實(shí)現高靈敏度分析可以***大程度地減少離子抑制。相比之下，用于離子和高極性分析物表征的其他色譜方法（如RP-MS、HILIC-MS、GC-MS和IP-MS）可能抑制分析物的離子特性（使用低質(zhì)子溶劑、衍生化等），以便提供有效的分析條件，這可能導致覆蓋范圍和信號抑制的偏差?？傊?，IC-MS已經(jīng)成為***種有效的互補（或替代）分析工具，表現出高水平的平臺穩定性、保留時(shí)間重現性、靈敏度和低檢測限。迄今為止，大多數應用集中在法醫科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、技術(shù)和制造業(yè)以及食品化學(xué)領(lǐng)域。然而，在制藥科學(xué)、臨床化學(xué)、診斷學(xué)、微生物學(xué)、代謝組學(xué)和細胞生物學(xué)等領(lǐng)域的應用越來(lái)越多，這些領(lǐng)域還有許多重要的進(jìn)***步發(fā)展和應用的空間（圖5）。無(wú)論是在復雜基質(zhì)中還是在高極性或離子分析物中，IC-MS都有新的應用空間。展望未來(lái)，我們認為IC-MS的未來(lái)應用將包括對復雜生物和環(huán)境系統和過(guò)程的深入研究，宿主-病原體關(guān)系，微生物組代謝，植物與土壤化學(xué)之間的關(guān)系，藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)，以及與疾病的診斷、預后和病因相關(guān)的生物標志物研究。從傳統意義上講，這些領(lǐng)域在分析上具有特殊的挑戰性，特別是在使用非靶向方法時(shí)；因此，IC-MS在發(fā)現導向和有針對性應用中有潛力發(fā)揮重要作用。
(文章來(lái)源于儀器網(wǎng))
