實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光集團，利用熒光信號來(lái)實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，***后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板濃度進(jìn)行定量分析。

其特點(diǎn)有：

(1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續的熒光監測，避免終點(diǎn)定量的不準確性，并且消除了標本和產(chǎn)物的污染，且無(wú)復雜的產(chǎn)物后續處理過(guò)程。

(2)熒光信號通過(guò)熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。Real-time O-PCR可以應用于mRNA表達的研究、DNA拷貝數的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定、細胞因子的表達分析、腫瘤耐藥基因表達的研究以及病毒感染的定量監測。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理

在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(cháng)。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號積累，實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中，測量的信號將作為熒光閾值的坐標。并且引入***個(gè)——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測到得熒光信號所需的***小循環(huán)數，是在PCR循環(huán)過(guò)程中熒光信號由本底開(kāi)始進(jìn)入指數增長(cháng)階段的拐點(diǎn)所對應的循環(huán)次數。

熒光閾值相當于基線(xiàn)熒光信號的平均信號標準偏差的10倍。***般認為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是***個(gè)可信的信號，可以用于定義***個(gè)樣本的Ct值。通常用不同濃度的標準樣品的Ct值來(lái)產(chǎn)生標準曲線(xiàn)，然后計算相對方程式。

方程式的斜度可以用來(lái)檢查PCR的效率，所有標準曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸分析需要存在***個(gè)高相關(guān)系數（R2＞0.99），這樣才能認為實(shí)驗的過(guò)程和數據是可信的，使用這個(gè)方程式計算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標準曲線(xiàn)中自動(dòng)地計算出未知樣本的初始模板量。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應用

1. 基因工程研究領(lǐng)域

①　基因表達研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測，其結果特異性強、定量準確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數據。

②　轉基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當的循環(huán)閾值，擴增***個(gè)轉移后的基因和***個(gè)對照基因，以分析轉基因老鼠接合性。該方法為45個(gè)轉基因動(dòng)物的同型結合及異質(zhì)結合提供了明確的鑒定結果。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測，同型結合的異質(zhì)接合動(dòng)物交配后其子代中轉基因的傳遞情況符合孟德?tīng)栠z傳規律。這項技術(shù)在轉基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應實(shí)驗中將有很大的用途。

③　單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR***個(gè)誘人的應用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩定性?；蛲蛔兓趦蓷l探針，***條探針橫跨突變點(diǎn)，另***條為錨定探針，與無(wú)突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標記。如靶序列中無(wú)突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會(huì )降低雜交體得穩定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。

2. 醫學(xué)研究領(lǐng)域

①　病原體檢測：由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可靠性和重復性好，并且操作簡(jiǎn)便、快速、結果判斷客觀(guān)，目前，人們用此方法對人類(lèi)免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結核桿菌、巨細胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測。熒光定量PCR問(wèn)世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標準。

②　藥物療效考核：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達。結果證明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統是定量檢測抗藥基因表達的可靠方法，應用這種技術(shù)可以預測化療將引起的反應。

③　腫瘤基因檢測：腫瘤的本質(zhì)是細胞內基因發(fā)生了變化，是***種多基因異常的疾病，這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法都可以檢測出來(lái)。  目前用此方法進(jìn)行過(guò)端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著(zhù)與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現。熒光定量PCR技術(shù)將會(huì )在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。

3. 其他領(lǐng)域

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對免疫組分進(jìn)行分析是其應用的重要方面。